Phosphorylierte N-glykan Epitope in einfachen Organismen

Lysosomale Proteine werden vom Golgi zu den Lysosomen durch molekulare Marker geleitet. Dazu werden die N-Glykane dieser Proteine im cis Golgi Kompartment mit einer Mannose-6-Phosphat Gruppe modifiziert. Solche Proteine werden dann im trans Golgi Apparat von Rezeptorproteinen erkannt, gebunden und zu den Lysosomen weitergeleitet. Während dieser Mechanismus in Vertebraten konserviert ist, sind in simplen Eukaryonten noch einige Fragen ungeklärt. Zwar ist diese Modifikation in Amöben vorhanden jedoch sind weder die Biosynthese noch die Funktion in diesen Organismen vollständig charakterisiert. Daher sollen die evolutionäre Aspekte der N-Glykanphosphorylierung in diesem Projekt mithilfe von zwei einfachen Modellorganismen untersucht werden: (i) dem Schleimpilz Dictyostelium discoideum, der in Folge von Nahrungsmangel multizelluläre Lebensformen bildet und (ii) der opportunistischen pathogenen Amöbe Acanthamoeba, die unter harschen Umweltbedingungen resistente Zysten bildet. Diese Studie befasst sich mit der Entstehung dieser Epitope (Mannose-6-Phosphat) und deren Erkennung durch Rezeptorproteine. Zuerst wird das Schlüsselenzym N-acetylglucosamin-1-phosphotransferase unter Verwendung synthetischer und nativer Substrate, wie N-Glykane und lysosomale Proteine aus Amöben charakterisiert. Die phosphorylierten N-Glykanepitope werden während der Differenzierungsvorgänge dieser Spezies mittels quantitative PCR, HPLC, und MALDI TOF MS/MS im Detail analysiert. Die Proteine, die mit phosphorylierten N-Glykanen modifiziert sind, werden mittels Immunopräzipitation angereichert und mit Massenspektrometrie identifiziert. Erstmals wird untersucht, ob die phosphorylierten N-Glykane in einfachen Organismen ausschließlich auf lysosomalen Proteinen vorkommen. Anschließend werden die Interaktionen dieser Proteine mit ihren potentiellen Rezeptoren untersucht. Diese Studie soll die Funktion der phosphorylierten Epitope entschlüsseln und damit auch ein besseres Verständnis der Evolution dieser speziellen N-Glykan-Modifikationen im Golgi Apparat erreichen.