BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem

Logo BOKU-Forschungsportal

Analysis of Thionin Proprotein Processing in Arabidopsis

Projektleitung
Bohlmann Holger, Projektleiter/in
Laufzeit:
01.03.2016-29.02.2020
Art der Forschung
Grundlagenforschung
Mitarbeiter/innen
Beteiligte BOKU-Organisationseinheiten
Abteilung Pflanzenschutz (PS)
Gefördert durch
Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF) , Sensengasse 1, 1090 Wien, Österreich
Abstract
Antimikrobielle Peptide sind ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems in Tieren und Pflanzen. Eine Gruppe von Pflanzen-spezifischen antimikrobiellen Peptiden sind die Thionine welche durch 3 oder 4 Disulfidbrücken stabilisiert werden. Sie werden zunächst als Präproproteine produziert welche aus einem Signalpeptid, dem eigentlichen Thionin und einer sogenannten sauren Domäne bestehen. Die reifen Thionine wurden in Zellwänden, Vakuolen und Proteinkörpern gefunden. Um die saure Domäne zu entfernen ist ein Thionin Proprotein Prozessierendes Enzym (TPPE) notwendig. In einem vorangegangenen FWF Projekt wurde solch ein TPPE aus Gerste isoliert und als eine Subtilase identifiziert. Ein Gersten Thionin Proprotein wurde von dem rekombinanten TPPE korrekt prozessiert. Dabei wurde die saure Domäne an mehreren Stellen gespalten. Dies erklärt, warum ein der sauren Domäne entsprechendes Protein niemals aus Pflanzen isoliert wurde. Das Thionin selbst war durch seine dreidimensionale Struktur, welche durch die Disulfidbrücken stabilisiert wird, vor dem TPPE geschützt.
In dem hier vorgestellten Projekt wird vorgeschlagen, diese Ergebnisse in der Pflanze zu bestätigen. Hierzu wäre Arabidopsis viel geeigneter als Gerste. Arabidopsis hat 4 Thioningene und eine Subtilase (AtSbt1.4) mit Homologie zum von uns isolierten Gersten TPPE.
Die Arabidopsis Subtilase AtSbt1.4 und 2 verwandte Enzyme (AtSbt1.2 und AtSbt1.7) wurden bereits in einem Expressionsvektor kloniert, ebenso alle 4 Arabidopsis Thionin Proproteine. Die Prozessierung dieser Proproteine soll zunächst in vitro analysiert werden. Anschliessend würde die Prozessierung in Arabidopsis Keimlingen untersucht werden. Es würden weiter auch transgene Pflanzen erzeugt werden, welche mit einem kurzen Peptid-Marker versehene Proproteine produzieren. In Summe sollten diese Ergebnisse die Subtilase AtSbt1.4 als TPPE bestätigen. Weiters ist geplant, die Anforderungen an die Proteinsequenz zwischen Thionin und saurer Domäne zu untersuchen. Dies würde vor allem mit einer Reihe unterschiedlicher Peptide geschehen. Diese würden mit rekombinanter AtSbt1.4 inkubiert und die Spaltung anschliessend mit Massenspektrometrie untersucht.
Ausserdem wird vorgeschlagen, die Lokalisierung der TPPE in der Zelle mit Hilfe von Antikörpern und GFP zu untersuchen. Wie viele pflanzliche Subtilasen enthält auch AtSbt1.4 eine PA Domäne und eine C-terminale Domäne über deren Funktion nicht viel bekannt ist. Es sollen deshalb AtSbt1.4 Mutanten erzeugt werden und deren Effekt auf die Prozessierung von Proproteinen untersucht werden. Ausserdem würde getestet werden, inwieweit diese beiden Domänen für die Lokalisierung des Enzyms innerhalb der Zelle wichtig sind.
Schlagworte
Molekularbiologie; Pflanzenphysiologie; Agrarbiotechnologie;
Antimicrobial Peptide; Arabidopsis; Subtilase; Thionin;
© BOKU Wien Impressum