Stabilisierung von Redoxenzymen für langzeit-implantierbare Sensoren
Abstract
Die moderne medizinische Diagnostik entwickelt sich hin zu kontinuierlichen Messmethoden, die in Echtzeit Daten liefern. Beispiel dafür sind Biosensoren, die in die Haut implantiert werden und dort den Blutzuckerspiegel messen. Mit sehr stabilen Enzymen für die Signalerfassung könnte die Nutzungsdauer von Tagen auf Monate oder Jahre ausgedehnt werden. Cellobiose dehydrogenase (CDH) ist ein Redoxenzym, das durch seine strukturelle Besonderheit einen direkten Elektronentransfer auf Elektroden eines Biosensors ermöglicht. Solche Flavocytochrome zeichnen sich durch hohe physikalische Stabilität aus. Der grundlegende Deaktivierungsmechanismus von CDH unter Arbeitsbedingungen ist weitgehend unerforscht. Gezeigt wurde bereits, dass die Deaktivierungsraten unter verschiedenen Arbeitsbedingungen unterschiedlich sind und auf eine Vielzahl von Effekten hinweisen. Für Glukoseoxidase, eines der meistgenutzten Flavinoxidasen in Blutzuckerbiosensoren, wurde unter anderem eine Deaktivierung durch das Reaktionsprodukt Wasserstoffperoxid festgestellt. Die Stabilität konnte durch Protein-Engineering erhöht werden. Eine Deaktivierung durch Wasserstoffperoxid wird auch in CDH vermutet. Im Gegensatz zur Glukoseoxidase besteht CDH aus einer weiteren Domäne, die ein Häm als Kofaktor gebunden hat. Hämproteine sind besonders anfällig für eine Deaktivierung durch oxidativen Stress. Durch Protein Engineering konnte bereits die Stabilität von cytochrome P450, Hämoglobin und Mangan-Peroxidasen erhöht werden. Im Rahmen von STARELIS soll der Deaktivierungsmechanismus von CDH aufgeklärt werden und als Grundlage für die Entwicklung von stabilen Enzymen für langzeit-implantierbare Biosensoren dienen. Durch eine Kombination von verschiedenen biochemischen Analysemethoden wie UV-Vis Spektroskopie, Circulardichroismus, Massenspektrometrie und Enzymkinetik mit Analysemethoden auf molekularer Ebene wie Enzymmutagenese und Proteinmodellen soll der Einfluss von verschiedenen Arbeitsbedingungen und oxidativem Stress auf CDH untersucht werden. In der Folge sollen Gerichtete Evolutions- und Rationales Design- Ansätze zur Verbesserung der Langzeitstabilität von CDH eingesetzt werden.
Cellobiose-Dehydrogenase Flavocyctochrom Glukosesensor implantierbar enzyme engineering
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Dietmar Haltrich
Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.techn. Dietmar Haltrich
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