Einsatz von rationellem Proteindesign zur Erhöhung der thermischen Stabilität von Enzymen und der Aufklärung ihres Faltungsmechanismuses
Abstract
Das Projekt beschäftigt sich mit der Aufklärung des Faltungsmechanismuses zweier Enzyme, Pyranose 2-oxidase (P2O) und dUTPase. Neben dem wissenschaftlichen Blickpunkt spielt dabei auch der technologisch wichtige Aspekt der Temperaturstabilisierung, und damit verbunden, der erhöhten Stabilität der Enzyme beim Einsatz in Reaktoren eine wichtige Rolle. P2O wird als Biokatalysator für die Umwandlung von Kohlenhydraten (z.B. Laktose aus Molke) in wertvolle präbiotische Zucker (z.B. D-Tagatose oder Laktulose) eingesetzt (Giffhorn 2000, Leitner et al. 1998). Die 3D Struktur dieses Enzyms wurde vor kurzen von einem Kooperationspartner in Schweden aufgeklärt (Hallberg et al. 2004). P2O erwies sich dabei als ein homotetrameres Enzym mit einer interessanten Struktur. In einem ersten Schritt bildet sich aus zwei Untereinheiten ein sehr stabiles, inaktives Dimer. Zwei dieser Dimere bilden das katalytisch aktive, aber thermisch wenig stabile Tetramer. Vom wissenschaftlichen Gesichtspunkt aus würde eine Analyse von Mutationen an der Dimer-Dimer Bindungsfläche einen tieferen Einblick in den Mechanismus der Oligomerisierung von Proteinen liefern. Technologisch betrachtet würden thermostabile P2O Varianten den Einsatz der Enzyms bei erhöhten Temperaturen erlauben (50°C anstelle von 30°C) was wiederum die Gefahr mikrobieller Infektionen drastisch reduzieren würde. Ein Aspekt der gerade in der Lebensmittelindustrie von großer Bedeutung ist. Ein Ziel dieses Projektes ist daher die Herstellung von P2O Varianten die diese Mutationen besitzen und (i) die detaillierte Analyse ihrer Oligomerisierung um neue Einblicke in den dahinterliegenden Mechanismus zu bekommen und (ii) die Durchführung von Umsetzungversuchen mit temperaturstabilen P2O Varianten . Die Enzymfamilie der dUTPasen ist verantwortlich für die Verhinderung des Einbaus von dUMP in die DNA. Diese Enzyme sind allgegenwärtig und essenziell, ein Fehlen führt zu einer Akkumulation von Uracil in der DNA was wiederum zum Zelltod durch Apoptose führt. Daher ist diese Enzyme ein neues und vielversprechendes Ziel für die Entwicklung von antimikrobiellen Chemotherapeutika gegen bakterielle, pilzliche oder virale Infekte, insbesondere gegen Tuberkulose und Malaria (Whittingham et al. 2005, Chan et al. 2004). Zusätzlich ist die humane dUTPase ein wichtiger Überlebensfaktor von multiresistenten Krebszelllinien und daher ein Ziel für Antikrebsmedikamente. Die 3D Struktur dieses Enzyms wurde vor kurzen in dieser Arbeitsgruppe aufgeklärt. Basierend auf dieser Struktur und einer Funktionsanalyse wurden einige interessante Faktoren für die Faltung und die Substratspezifität entdeckt. Um die Struktur und die Funktion der dUTPase besser verstehen zu können sind allerdings weiter Untersuchungen notwendig. So ist z.B. die Formung eines Homotrimers unabdingbar für eine korrekte Funktion dieses Enzyms. Ein weiteres Ziel dieses Projektes ist es daher zu untersuchen welche Interaktionen ausschlaggebend sind für die Bildung und die Stabilität dieses Trimers. Die Ergebnisse sind wichtig um Liganten zu designen die effektiv die Aktivität von dUTPase hemmen und die wiederum als Ausgangspunkt für die Herstellung von Inhibitoren dienen können.
Schlagworte Enzyme Pyranose 2-oxidase dUTPase Thermostabilität gerichtete Evolution
Publikationen
Mitarbeiter*innen
Christian Leitner
Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Christian Leitner
Projektleiter*in
01.06.2008 - 31.05.2009
Oliver Spadiut
Assoc. Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Oliver Spadiut
Projektmitarbeiter*in
01.06.2008 - 31.05.2009
BOKU Partner
Externe Partner
Hungarian Academyof Sciences
Beata Vertessy
Partner