Evolution und Design von Pyranose Oxidoreduktasen für veränderte Sauerstoff-Reaktivität
Abstract
Reaktionen von Flavin-Oxidoreduktasen bestehen aus einer reduktiven Halbreaktion, in welcher das Substrat den Flavin-Cofaktor reduziert, und einer oxidativen Halbreaktion, in welcher das Flavin durch einen Elektron-Akzeptor re-oxidiert wird. Flavin-abhängige Oxidasen nutzen molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor und produzieren Wasserstoff-Peroxid, Dehydrogenasen reagieren sehr langsam oder gar nicht mit Sauerstoff und übertragen Elektronen auf alternative Akzeptoren wie (substituierte) Quinone oder Redox-Proteine. Trotz intensiver Forschung konnte die chemische und strukturelle Grundlage der Sauerstoff-Reaktivität noch nicht entschlüsselt werden, spezifische Bindungsstellen für Sauerstoff oder alternative Akzeptoren konnten nicht gefunden werden. Wiewohl einige Aminosäuren in einzelnen Proteinen aus verschiedenen Strukturfamilien die Sauerstoff-Reaktivität entscheidend beeinflussen konnten keine klaren strukturellen Regeln identifiziert werden, die darüber entscheiden ob ein Enzym als Oxidase oder als Dehydrogenase arbeitet. Pyranose 2-oxidase und Pyranose Dehydrogenase sind zwei Flavin-abhängige Zucker-Oxidoreductasen aus (hauptsächlich) Basidiomyzeten, welche die regioselektive Oxidation verschiedener Aldopyranosen an C-2 (und seltener an C-3) katalysieren. P2Ox ist eine homotetramere Oxidase, PDH ist ein monomeres Glykoprotein und benötigt alternative Akzeptoren wie 1,4-Benzoquinone, das Ferricenium-Ion und Ferrizyanid. Beide gehören zur GMC-Familie der Flavoproteine, und ihre aktiven Zentren zeigen hohe Ähnlichkeit. Gene für beide Enzyme wurden in unserem Labor isoliert, und die heterologe Expression etabliert. Wir wollen mit einer Kombination aus gerichteter Labor-Evolution und semi-rationaler Proteinmodifikation die Sauerstoff-Reaktivität dieser beiden Enzyme verändern, und dafür entscheidende Aminosäuren identifizieren. Mini-Expressionsgenbanken von Enzymvarianten werden durch Sättigungsmutagenese hergestellt, sowie Expressionsgenbanken von zufällig mutierten p2ox- and pdh-Genen (durch Fehlerhafte PCR), und in einem parallelen Enzymtest auf Änderungen in der Reaktivität mit Sauerstoff und alternativen Akzeptoren durchsucht. Mutationen mit entsprechenden Effekten werden detailliert biochemisch charakterisiert werden. Die Ähnlichkeit der aktiven Zentren der beiden Enzyme erlaubt die Überprüfung des Effekts einzelner Aminosäuren-Änderungen, indem die gleichen sowie komplementäre Änderungen in beiden Enzymen eingeführt werden können. Neben dem wissenschaftlichen Aspekt hat diese Arbeit auch Relevanz für gewisse Anwendungen: Die störende Wasserstoff-Peroxid-Produktion durch P2Ox könnte vermieden werden, oder Biokatalyse-Prozesse mit der flexibleren PDH ohne komplexe Redox-Mediatoren-Regeneration könnte ermöglicht werden.
Flavoproteine Zucker-Oxidoreduktasen Elektronenakzeptoren Enzymdesign Gerichtete Evolution
Publikationen
Mitarbeiter*Innen
Clemens Karl Peterbauer
Assoc. Prof. Dr. Clemens Karl Peterbauer
clemens.peterbauer@boku.ac.at
Tel: +43 1 47654-75212
Projektleiter*in
01.03.2010 - 31.05.2013