University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna (BOKU) - Research portal
Electroporation as method for inserting functional membrane proteins in mammalian cells - without use of genetic manipulation
- Project Leader
- Ehmoser Eva-Kathrin, Project Leader
- Duration:
- 01.01.2015-31.01.2018
- Programme:
- Joint Projects
- Type of Research
- Basic Research
- Staff
- Küpcü Seta, Project Staff
- Tan Cherng-Wen Darren, Project Staff
- BOKU Research Units
-
Institute of Synthetische Bioarchitekturen
- Funded by
-
Austrian Science Fund (FWF) , Georg-Coch-Platz 2, 1010 Wien, Austria
- Abstract
- Gentransfektion einer Zelle um Fremdproteine herzustellen, ist eine übliche Methode. Im Resultat entsteht eine Zelle, die damit in der Lage sind, neue Funktionen zu erhalten, bzw. neue Rollen in einem Gewebekontext einzunehmen. Es gibt zahlreiche Beispiele für diese Forschungrichtung, die durchaus schon seit Dekaden existieren. Die Methode der genetischen Manipulation von Zellen gibt es sowohl in transienter, als auch für stabile, permanenter Proteinherstellung in Zellen. Grundsätzlich hängt es davon ab, welche Strategie yur genetischen Manipulation verwendet wird: Integration der kodierenden genetischen Information in das Genom einer Zelle, oder eben die Verwendung von Shuttlesystemen, die Plasmide. Die Regulation der Proteinherstellung in beiden Strategien ist nach wie vor extrem schwierig, was einen bekannter Nachteil in der Gentherapieforschung darstellt.
In jedem Fall wird die Synthese eines fremde Gen typischerweise von einem mehr oder weniger starken Promotor kontrolliert, wodurch die biochemischen Resourcen einer Zelle stark strapaziert werden, bzw. Stressregulationsstoffwechselwege aktiviert werden. Resultat dieser Synthesestrategien ist oft eine begrenzte Lebensfähigkeit der proteinherstellenden Zellen – bis hin zum Zelltod. Ausserdem ist die Regulation der Verfügbarkeit, Funktionalität-Aktivität der einzuschleusenden Proteine in lebende Zellen ein bisher bekanntes und grosses Problem für die Weiterentwicklung therapeutischer Strategien, die auf Gentherapie basieren.
Eine attraktive Alternative zu der Gentransfektion besteht darin, das gewünschte Membranprotein als fertiges Bauteil in eine Zelle hineinzubringen. Dazu soll im Rahmen dieses Antrages eine Architektur entwickelt werden, die ein funktionell gefaltetes Membraneprotein enthält. Das würde effektiv die Regulationsproblematik der Herstellung eines Fremdproteines durch eine Gastzelle umgehen und – was noch viel bedeutender erscheint, die Notwendigkeit und Einschränkungen umgehen, wie eine Zelle die Existenz eines Proteins auf cotranslationaler Ebene kontrolliert. Verschiedene physikalische Methoden sind bereits entwickelt worden, um Membranproteine in Zellen hineinzubringen, wie Microinjektion, Osmotic shock und Trypsinisierungsmethoden. Eine für uns in diesem Kontext bekannte und interessante, da sehr präzise Methode, stellt die Elektroporation dar. Damit moechten wir ‘intrazelluläre Implantate’ auf molekularer Ebene herstellen, indem wir solch membranstabilisierten, zellfrei hergestellten Membranproteine in die äussere Membran lebender Zellen hineinfusionieren.
Für die Herstellung solcher Protein-Membranassemblies haben wir die zellfreie Synthese über die letzen zwanzig Jahre als Methode erfolgreich entwickelt. Sowohl in Phospholipidarchitekturen, wie vesikeln, als auch in Polymerarchitecturen, die aus amphiphilen Blockkopolymeren aufgebaut sind, koennen, wir in gegenwart von Ribosomen-Chaperonen und den entsprechenden Bausteinen, funktionsfähige Membranproteine herstellen. Damit hoffen wir, eine neue Strategie für die Herstellung von Membanproteinen angestossen zu haben, die es ermoeglicht, mit allen post und ko- translationalen Modifikationen, eine entprechende DNA in das jeweilige Membranprotein zu übersetzen und, im Rahmen dieses Antrages, diese Assemblies in lebende Zellmembranen via Elektroporation einzubetten.
- Keywords
-
Biophysics;
Molecular biology;
Medical biochemistry;
-
Electroporation;
Membrane Biochemistry;
Method development;
