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Krisztina Koczka (2019): VIRAL ENGINEERING FOR AN IMPROVED INSECT CELL-BASED PRODUCTION PLATFORM.
Dissertation - Institut für Biotechnologie, BOKU-Universität für Bodenkultur, pp 75. UB BOKU obvsg FullText

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Abstract:

Das Baculovirus-Insektenzellen-Expressionssystem wird oft zur Produktion rekombinanter Proteine verwendet. Jedoch ist es unter den etablierten eukaryotischen Produktionsplattformen ein besonderes System, da die rekombinante Proteinexpression an eine lytische Infektion mit Baculoviren gekoppelt ist. Dies bringt bestimmte Einschränkungen mit sich, wie z. B. Hindernisse beim Aufbau kontinuierlicher Bioprozesse, die Induktion von Stress und den Unfolded Protein Response im Insektenwirt bei der Produktion rekombinanter Proteine sowie die gleichzeitigen Bildung kontaminierender Baculovirus-Partikel während der Produktherstellung. Diesen Schwächen, z. B. der geringen Ausbeute an löslichem Produkt und der mühsamen Weiterverarbeitung muss entsprechend begegnet werden, um diese negativen Folgen zu umgehen. Der erste Teil der Arbeit konzentriert sich auf die Aufklärung sekretorischer und metabolischer Engpässe in Insektenzellen, die zur Bildung von Proteinaggregaten führen, ausgelöst durch Infektion mit Baculoviren, die ein heterologes lösliches Protein kodieren. Nicht nur wichtige Prozessierungs- und Faltungsenzyme, auch Chaperone, die durch die direkte Stressantwort und die parallel dazu stattfindende hohe Fremdproteinbildung induziert werden, wurden durch eine vergleichende Transkriptomanalyse in einer Trichoplusia ni Zelllinie identifiziert. Diese spezifisch regulierten Gene stellen interessante Ziele für zukünftige Zelllinienentwicklung und virale Vektorentwicklung dar. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung eines induzierbaren Gen-Knockdown Systems zur effektiven Stilllegung von Insekten- oder Virusgenen während eines Infektionsprozesses. Das etablierte System nutzt den natürlichen RNA-Interferenz Mechanismus in Insektenzellen in Kombination mit der prokaryotischen T7-Transkription Maschinerie. Am Beispiel der Herunterregulierung eines Modellfluoreszenzproteins erwies sich das Doppelvektorsystem als funktional und geeignet für zukünftige Experimente an essentiellen Genen für die Baculovirus-Entstehung, zur Reduktion der Virusmenge im Überstand.

Betreuer: Grabherr Reingard

1. Berater: Jungbauer Alois

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