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Gewählte Dissertation:
Linda Schwaigerlehner
(2019):
Germline-based approaches for Fv engineering and the effect on IgG properties and expression in mammalian cells.
Dissertation - Institut für Biotechnologie,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 136.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Monoklonale Antikörper (mAbs) haben in der Analytik, Diagnostik sowie in der Humantherapie eine große Bedeutung erlangt. Um die Affinitäten zu verbessern und die Immunogenität zu verringern, wurden verschiedene Engineering-Strategien für das variable Fragment (Fv) von mAbs entwickelt. Verbesserungen auf technologischer Ebene zielen auf die Proteinexpressionsrate und eine verbesserte Proteinstabilität ab. Diese Effekte sind jedoch aus Sequenzperspektive kaum vorhersehbar. Im ersten Teil der Arbeit wurden entscheidende Aminosäuren und deren Wechselwirkung im Fv eines superhumanisierten mAb untersucht. Der Einfluss eines Strukturelements, des sogenannten „tyrosine cage“, und die Rolle der zentralen Aminosäure des „tyrosine cage“, Arginin, sowie Mutationen in der variablen leichten Kette des humanisierten mAb wurden bestimmt. Es wurde gezeigt, dass selbst Mutationen in der leichten Kette eine signifikante Verbesserung der Bindungsaffinität ermöglichen. Im zweiten Teil wurden Paare von reifen und Keimbahnantikörpern in CHO-Zellen exprimiert und deren Zellbiologie und Proteineigenschaften untersucht. Es wurde gezeigt, dass sich die Keimbahnantikörper gemäß vordefinierter Eigenschaften der jeweiligen Keimbahnfamilien verhalten und dass jeder mAb individuell betrachtet werden sollte. Schließlich wurden differentiell exprimierte Gene von CHO-Zelllinien, die ein schwer exprimierbares IgG und die entsprechende Keimbahnvariante produzieren, bestimmt. Die Transkriptomanalyse der untersuchten CHO-Zelllinien zeigte Expressionsunterschiede von Genen, die mit der Plasmamembran und dem extrazellulären Raum assoziiert sind. Darüber hinaus konnte eine bemerkenswerte Anzahl von differentiell exprimierten langen nicht-kodierenden RNAs mit unbekannter Funktion identifiziert werden. Zusammenfassend konnten wir die Wechselbeziehung der Primärsequenz von mAbs und biophysikalischen Proteineigenschaften untersuchen sowie Transkriptionsunterschiede zweier Expressionszelllinien bestimmen.
- Betreuer: Kunert Renate
- 1. Berater: Oostenbrink Chris