BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
Patrick Stargardt
(2021):
Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli.
Dissertation - Institut für Bioverfahrenstechnik,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 183.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Die rekombinante Proteinproduktion (RPP) ist in mikrobiellen Expressionssystemen wachstumsassoziiert und daher werden metabolische Ressourcen eher in die Bildung von Biomasse als in die heterologe Produktbildung geleitet. Folglich steht die Expression des Zielproteins (ZP) immer in direkter Konkurrenz zur simultanen Produktion von Wirtsproteinen durch die Transkriptions- und Translationsmaschinerie der Zelle. Dies führt zu einer metabolischen Überlastung der Zellfabrik.
Im Zuge dieser Arbeit wurde ein Produktionsprozess für ein auf Escherichia coli (E. coli) basierendes Expressionssystem entwickelt, welches es ermöglicht die RPP vom Zellwachstum zu entkoppeln.
Diese Technologie, genannt enGenes-X-press, besitzt die Fähigkeit die Produktion eines ZP, durch die zusätzliche Expression eines vom Phagen T7 stammenden Proteins (Gp2), zu verbessern. Gp2 ist in der Lage die E. coli RNA-Polymerase zu binden und die σ70-vermittelte Bildung von transkriptions-qualifizierten offenen Promotor-Komplexen zu verhindern. enGenes-X-press ermöglichte es die Gesamtausbeute an löslichen Proteinen um das bis zu 3,4-fache zu erhöhen.
Da eine genaue Regulation der Genexpression für die Produktion schwer zu exprimierender Proteine von Bedeutung ist, wurde im Zuge dieser Arbeit ein neuartiger Produktionsstamm entwickelt, welcher auf der enGenes-X-press-Technologie basiert. In BL21-AI
ist es möglich ein Zielgen, unter Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promoters (T7 Promoter), mit L-Arabinose zu induzieren. Dieses Expressionssystem ist in der Lage, durch Pulsinduktion mit verschiedenen L-Arabinose Konzentrationen, die Proteinexpressionsraten auf zellulärer Ebene zu steuern und gleichzeitig die RPP zu erhöhen. Darüber hinaus haben wir im Verlauf dieser Arbeit gezeigt, dass die Induktoren der beiden Promotoren, Plac und ParaBAD, sich gegenseitig beeinflussen. L-Arabinose kann Plac verwandte Promotoren (T7 Promoter) induzieren und umgekehrt wirkt IPTG als Inhibitor für ParaBAD Systeme. - Betreuer: Striedner Gerald
- 1. Berater: Grabherr Reingard
- 2. Berater: