BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Monika Mueller
(2004):
Entwicklung und Optimierung von Analyseverfahren zur Charakterisierung der mikroökologischen Situation der Intestinalflora.
Diplomarbeit / Masterarbeit,
BOKU-Universität für Bodenkultur.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Der Großteil der Intestinalflora ist noch unerforscht. Moderne molekularbiologische Methoden wie z. B. die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) tragen entscheidend zur weiterführenden Analyse der Darmflora bei. In dieser Arbeit wurde die FISH-Technologie mit dem zur Verfügung stehenden Equipment etabliert und für die Untersuchung von Laktobazillen und Bifidobakterien in Stuhlproben optimiert. Zur Hybridisierung der Laktobazillen und Enterokokken wurde die Lab158-Sonde und für die Bifidobakterien die Bif164-Sonde eingesetzt. Diese DNA-Oligonucleotidsonden sind zu Abschnitten der 16S rRNA in den Zellen komplementär. Durch Gegenfärbung mit DAPI wurde die Gesamtzellzahl bestimmt. Sämtliche Parameter wie Probenverarbeitung, Fixierungsdauer und Permeabilisierung wurden an die Probenmatrix angepasst. Durch Permeabilisieren mit Proteinase K oder mit einer Kombination von Lysozym und Proteinase K konnte die Hybridisierungsrate der Enterokokken von 26 auf 78% und die der Laktobazillen von 8% auf 19% gesteigert werden. Die Hybridisierungsrate der Bifidobakterien blieb konstant auf hohem Niveau (90%). Mittels kultureller Methoden wurden neun mikrobiologische Parameter (Aerobier, Anaerobier, Gram-negative Anaerobier, Bifidobakterien, Laktobazillen, Bacteroides, Clostridien, Enterokokken und Enterobacteriaceae)von Fäzesproben bestimmt und mit den Ergebnissen der FISH-Methode verglichen. Die Gesamtzellzahl, ermittelt durch die DAPI-Färbung lag 1,5 mal so hoch wie die der kulturell ermittelten Gesamtanaerobier. Die Zellzahl der Bifidobakterien, ermittelt durch die FISH-Methode, lag etwas niedriger und die der Laktobazillen zehn mal so hoch wie die Keimzahl auf den Platten. Die neu etablierte Methode lieferte Werte, die mit jenen aus der Literatur vergleichbar sind. Diese Entwicklung stellt die methodische Grundlage für eine humane Ernährungsstudie dar.
- Beurteilende(r): Kneifel Wolfgang