BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Diplomarbeit / Masterarbeit:
Dieter Palmberger
(2007):
Generation of recombinant Influenza A derived Ribonucleoprotein complexes.
Diplomarbeit / Masterarbeit,
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 68 Seiten.
UB BOKU
obvsg
FullText
- Abstract:
- Influenza A basierende Ribonucleoproteincomplexe (RNP) bestehen aus negativ-strängiger RNA, die von Nucleoprotein (NP) umgeben ist. Komplementäre Regionen an den 5' und 3' Enden können sich zu einer Duplexstruktur zusammenlagern, was von essentieller Bedeutung für Transkription und Replikation ist. Diese werden von einer heterotrimeren Polymerase, bestehend aus PA, PB1 und PB2 Subeinheiten, bewerkstelligt, welche an die Duplexstruktur der viralen RNA gebunden ist. Auf Grund der Tatsache das Influenza A RNP Komplexe die minimal nötigen infektiösen Partikel darstellen, wird ihre Verwendung für in vitro / in vivo Gene delivery und für die Generierung rekombinanter Viren angedacht. Eine weitere Verwendungsmöglichkeit besteht im Bereich der Impfstoffentwicklung. Das Ziel dieser Arbeit war es die 4 RNP-Proteine unter zur Hilfenahme von Baculoviren rekombinant in einem Insektenzellsystem zu exprimieren. Wir haben damit begonnen die für die RNP Bildung ideale MOI / hpi Kombination zu ermitteln und weiters versucht die Komplexe mittels Blue Native Page in ihrem nativen Zustand sichtbar zu machen. Im nächsten Schritt isolierten wir nukleäre RNP Komplexe mittels Ultracentrifugation und bestätigten deren Anwesenheit in der Pellet-Fraktion mittels Western Blot. Um die Funktionalität der viralen Polymerasen zu zeigen, wurden Sf9 Zellen mit Baculoviren die die 4 RNP-Proteine exprimieren, als auch mit Baculoviren die negativ-strängige RNA (kodiert für ein GFP Fusionsprotein) zur Verfügung stellt, infiziert. Wenn nun die Polymerasen aktiv sind, kommt es zur Expression von GFP. Um in weitere Folge die Aktivität der Polymerasen zu testen, wurden Sf9 Zellen mit Baculoviren, die RNP-Proteine codieren, infiziert, mit in vitro transkripeirter RNA transfiziert und auf GFP-Expression hin beobachtet. Die Korrektheit der in vitro transkriperten RNA konnte durch Infektion von MDCK und CHO Zellen mit dem Influenza A Stamm PR/8/34 und anschleißender RNA Transfektion gezeigt werden.
- Beurteilende(r): Grabherr Reingard