BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
Katharina Spath
(2012):
Plasmids for industrial lactic acid bacteria strains: from shuttle vector design to direct cloning of PCR-fragments.
Dissertation - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 85.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Milchsäurebakterien sind von großem wirtschaftlichem Interesse und viele Bemühungen hinsichtlich der Erweiterung ihrer metabolischen Fähigkeiten durch gentechnische Methoden wurden unternommen. Die ersten Schritte in Richtung Stammverbesserungen sind die Etablierung effizienter und reproduzierbarer Transformationsprotokolle sowie die Identifizierung von genetischen Elementen die eine ausreichende und stabile Expression eines Zielgens ermöglichen. In dieser Arbeit wurden neue Vektorsysteme und effiziente Transformationsprotokolle für die zwei Silagestämme Lactobacillus plantarum CD033 und Lactobacillus buchneri CD034 entwickelt und evaluiert. Transformationsprotokolle mit Effizienzen, die deutlich über denen in der Literatur beschriebenen liegen, konnten etabliert werden. Weiters testeten wir die Eignung verschiedener Replikationsursprünge für die Konstruktion von neuen Shuttel- und Expressionsvektoren. Ihre Replikationsfähigkeit und ihr Einfluss auf die Plasmidkopiezahl, -stabilität und -inkompatibilität in L. plantarum CD033 und L. buchneri CD034 wurden untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass zwei erst vor Kurzem identifizierte Replikationsursprünge aus L. buchneri CD034 am Besten für die Konstruktion von stabilen Expressionsvektoren mit hoher Kopienzahl geeignet sind. Darüber hinaus untersuchten wir den Einfluss der Methylierung von Plasmid-DNA auf die Transformationseffizienz. Durch Verwendung von nichtmethylierter Plasmid-DNA konnte eine signifikante Verbesserung der Transformationseffizienz in L. plantarum CD033 erreicht werden. Mit Effizienzen von rund 10^9 kolonienbildende Einheiten/µg DNA war es möglich einen direkten Klonierungsansatz für L. plantarum CD033 zu etablieren und minimale Plasmide zu konstruieren. Die Ergebnisse dieser Studie liefern einen Baukasten von neuen grundlegenden genetischen Werkzeugen, der eine zeitsparende und maßgeschneiderte Stammverbesserung der zwei wichtigsten Silagespezies erlaubt.
- Betreuer: Grabherr Reingard
- 1. Berater: