BOKU - Universität für Bodenkultur Wien - Forschungsinformationssystem
Gewählte Dissertation:
Martina Baumann
(2011):
Identification and characterisation of endogenous and artificial mammalian active promoter sequences.
Dissertation - Institut für Angewandte Mikrobiologie (IAM),
BOKU-Universität für Bodenkultur,
pp 190.
UB BOKU
obvsg
- Abstract:
- Die CHO (Chinese Hamster Ovary) Zelllinie ist eine der populärsten Expressionssysteme für die Produktion von rekombinanten biopharmazeutischen Proteinen. Bislang basieren Standardtechnologien auf Expressionskassetten, welche starke, virale Promotoren enthalten, wie zum Beispiel den CMV oder SV40 Promoter. Der konstitutiv hohe Expressionslevel kann jedoch Nachteile mit sich bringen, wie unter anderen eine vorzeitige Aktivierung von Apoptose oder anderen Stessreaktionen, die zu ungenügend prozessierten heterogenen Proteinen führen. Diese Probleme können durch die Verwendung alternativer Promotersysteme vermieden werden, wie durch den Einsatz endogener Promotoren, genetisch veränderter oder induzierbarer Promotoren. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt einen Ansatz zur Identifizierung funktioneller CHO endogener Promoterelemente mithilfe von Chromatinimmunpräzipitation (ChIP). Hierbei wurde das Promoter-spezifische Protein TAF1 verwendet, welches die größte Untereinheit des allgemeinen Transkriptionsfaktors TFIID darstellt. DNA Fragmente, die mit Hilfe von ChIP isoliert werden konnten, wurden in einen Reportervektor kloniert, um die Funktionalität der identifizierten Sequenzen zu überprüfen. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Charakterisierung des CHO endogenen S100a6 Promoters, welcher mittels Plaque-Hybridisierung, basierend auf Microarray Expressionsdaten, isoliert werden konnte. Dieser Promoter zeigt einen hohen Expressionslevel, welcher unter hypothermen Bedingungen weiter gesteigert werden kann. Unsere Versuchsergebnisse demonstrieren, dass dieser starke und temperaturregulierbare Promoter hohes Potential hat, die rekombinante Proteinproduktion in Säugetierzellen zu verbessern. Gesteigerte Genexpression wurde sowohl auf Proteinebene, als auch mRNA Ebene untersucht. Der dritte Ansatz dieser Arbeit basiert auf einer statistischen Methode, um neuartige DNA-Motive zu erforschen. Durch Computeranalysen wurden bislang unentdeckte Sequenzelemente identifiziert, welche per se im Stande sind Transkription zu initiieren. Einige der artifiziellen Sequenzen weisen Promoteraktivitäten vergleichbar mit dem SV40 Promoter auf und sind imstande, die allgemeinen Transkriptionsfaktoren TFIIB und TFIID zu binden.
- Betreuer: Grabherr Reingard
- 1. Berater: Ernst Wolfgang
- 2. Berater: Borth Nicole